皮質(zhì)醇ELISA試劑盒常見的定量方法

　　測定原理：現(xiàn)在皮質(zhì)醇ELISA試劑盒除非是測定抗體的以外，一般使用的是雙抗體夾心法，此種方法大多數(shù)用的是增強的雙抗體夾心法，即使用生物素-親和素系統(tǒng)，還有少數(shù)的指標(biāo)可能使用競爭法，這類方法適用于半抗原的測定。

　　具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多表位蛋白抗原，其雙抗體夾心法中的一個抗體必須用單抗，否則背景很高。當(dāng)然如果兩個都是單抗(這兩個單抗針對不同表位)，那么測定的線性范圍就較寬，試劑盒性能就較好；一個用單抗，一個用多抗，測定的靈敏度會較高。

　　某些簡單的化合物用皮質(zhì)醇ELISA試劑盒測定時，因為沒有兩個或以上的表位，一般只能作為半抗原，只能用競爭法測定。如果你發(fā)現(xiàn)有測定簡單化合物(如雌激素、NO、地高辛等)用雙抗體夾心法作測定原理時，這個試劑盒你就要懷疑了。另外還要說明一步雙抗體夾心法與兩步雙抗體夾心法的區(qū)別。

　　一步雙抗體夾心法的吸光度-劑量曲線呈鐘形，隨著待則標(biāo)本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應(yīng)”(hookeHect)，也就是我們在免疫沉淀試驗中所稱的“帶現(xiàn)象”(zonephenomenon)。所以當(dāng)使用一步雙抗體夾心法時，樣品濃度太高，有時會出現(xiàn)測不出來的現(xiàn)象，此時要作適當(dāng)?shù)南♂尣拍軠?zhǔn)確測定。

　　皮質(zhì)醇ELISA試劑盒的組成：用雙抗體夾心法作為測定的方法時，試劑盒的組成一般包括：已包被單抗的酶標(biāo)板：一塊，有96孔的，也有48孔的，可拆缷，外面有鋁箔袋密封，打開后有干燥劑，實驗時暫未使用的酶標(biāo)條要連帶干燥劑密封好，放在4℃冰箱中妥善保存。

　　皮質(zhì)醇ELISA試劑盒操作步驟

　　1、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。

　　2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

　　3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。

　　4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

　　5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

　　6、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對照孔不加。

　　7、溫育：重復(fù)4的操作。

　　8、洗板：重復(fù)5的操作。

　　9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，37℃避光顯色15min。

　　10、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

　　11、測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。

　　12、計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。最終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。