一、原理簡(jiǎn)介

　　改進(jìn)的異硫氰酸胍/酚一步法裂解細(xì)胞和滅活 RNA 酶，然后總 RNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗——離心的步驟，漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的 RNasefree water 將純凈 RNA（microRNA）從硅基質(zhì)膜上洗脫。

　　二、試劑盒特點(diǎn)

　　1． 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

　　2． 結(jié)合了異硫氰酸胍/酚一步法試劑穩(wěn)定性好，純度高和離心柱方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，不需要異丙醇沉淀和乙醇洗滌過(guò)程，RNA 可以直接從離心柱上洗脫避免了過(guò)度干燥不易溶解問(wèn)題。

　　3． 獨(dú)有的 MRL 裂解液配方，可以有效的消除基因組污染。

　　4． 多次漂洗去蛋白過(guò)程，提取 RNA 純度更高。

　　三、注意事項(xiàng)（實(shí)驗(yàn)前必須首先閱讀這部分?。?br />
　　1． 為防止RNA降解，所有離心步驟如未加說(shuō)明，均在4℃低溫進(jìn)行。使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf5415C 或者類(lèi)似離心機(jī)。

　　2． 裂解液 MRL 中含有刺激性有害化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

　　3． 預(yù)防 RNase 污染，在實(shí)際的操作中應(yīng)遵循以下指南（參見(jiàn)《分子克隆》）* 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來(lái)源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。* 使用滅菌的、一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。* 使用無(wú) RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150°C 的烘箱中烘烤 4 小時(shí)，塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

　　4． 考慮到環(huán)保問(wèn)題，本試劑盒不含有實(shí)驗(yàn)室常用試劑，用戶使用前需要自備。

　　5． 常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳和變性膠電泳均可以用來(lái)分析大 RNA 的質(zhì)量。好的 RNA 產(chǎn)物在電泳后應(yīng)該可以看到明顯的二條優(yōu)勢(shì)核糖體 RNA 帶，分別為——5Kb（28S），——2Kb（18S），條帶亮度比值約為 2：1。

　　6． 檢測(cè) OD260/OD280吸光度比值時(shí)，RNA 樣品應(yīng)該溶于 TE 后檢測(cè)，如果用水稀釋后檢測(cè)，由于一般水離子強(qiáng)度和 PH 值低，會(huì)使 OD280升高，從而使比值降低。

　　7． 加入裂解液 MRL 勻漿后，加前，樣品可在 –60℃-70℃ 保存一個(gè)月以上。

　　五、操作步驟