單細(xì)胞生物學(xué)是當(dāng)今的熱門話題。其中，最前沿的領(lǐng)域當(dāng)屬單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)了。常規(guī)RNA測序方法能一次性加工測序成千上萬個細(xì)胞，并給出平均差異。

　　沒有兩個細(xì)胞是完全一樣的，而新型的scRNA-seq方法就能揭示細(xì)胞中產(chǎn)生每種特異性的微小改變，甚至這種技術(shù)還能闡明完整的新細(xì)胞類型。

　　例如，當(dāng)美國馬薩諸塞州博德研究所研究員Aviv Regev等人利用scRNA-seq對2400個免疫系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行探查時，無意中發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在T細(xì)胞激活活性的樹突細(xì)胞。Regev表示，能刺激這些細(xì)胞的疫苗或可潛在增強機(jī)體免疫系統(tǒng)，并且保護(hù)機(jī)體抵御癌癥。

　　但這些發(fā)現(xiàn)都來之不易。與大量細(xì)胞相比，研究人員很難對單個細(xì)胞進(jìn)行操作，因為每種細(xì)胞僅會產(chǎn)生少量的RNA，于是沒有犯錯的余地。另外一個問題是，如何對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析——目前的工具可能并不直觀。

　　《自然》雜志報道指出，一般而言，RNA測序數(shù)據(jù)能被以指令的形式輸入到Unix操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)文件會從一個軟件包傳輸?shù)搅硗庖粋€，在這個過程中，每個工具都要對每個步驟進(jìn)行處理：例如基因組比對、質(zhì)量控制、識別突變體等。而這個過程非常復(fù)雜。

　　但對于大量的RNA測序而言，研究人員可以利用算法對每個步驟進(jìn)行處理，而且他們也非常清楚每個過程的運行狀況。英國癌癥研究所計算生物學(xué)家Aaron Lun表示，為了分析不同的基因表達(dá)，大規(guī)模RNA測序“基本上能解決問題”。對于scRNA-seq而言，人們還需要找到更便捷的方法分析數(shù)據(jù)集和編寫更有用的算法。

　　如今，人們有很多在線資源和工具能簡化scRNA-seq數(shù)據(jù)分析過程，其中名為GitHub的平臺就整合了70多種工具和資源，而且相關(guān)的工具和資源能覆蓋分析過程的每一步。

　　定制技術(shù)

　　美國夏威夷大學(xué)生物信息學(xué)家Lana Garmire在2016年發(fā)表的一篇研究報告中列出了他們進(jìn)行scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的基本步驟。盡管每個實驗都具有特殊性，但很多分析流程都是按照相同的步驟對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾以及排序的，同時還能夠找出哪些轉(zhuǎn)錄物會被表達(dá)，并能糾正擴(kuò)增效率的差異性。隨后研究人員就能夠進(jìn)行一個或多個二級分析檢測亞群和其他功能。

　　威斯康星大學(xué)麥迪遜分校生物統(tǒng)計學(xué)家Christina Kendziorski談道，在許多情況下，大規(guī)模RNA測序使用的工具也可以應(yīng)用于scRNA-seq。但數(shù)據(jù)的根本差異意味著，這并不總是可行的。

　　Lun也表示，一方面，單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的背景噪聲更大。在如此少量RNA的情況下，擴(kuò)增和捕獲效率的微小變化，就可能在細(xì)胞間產(chǎn)生與生物學(xué)無關(guān)的巨大差異。因此，研究人員必須對“批量效應(yīng)”保持警惕，因為在不同日期制備的看似相同的細(xì)胞，可能因為純粹的技術(shù)原因而不盡相同，導(dǎo)致“中途退出”的基因在一些細(xì)胞中表達(dá)，但在測序的數(shù)據(jù)中卻沒有發(fā)現(xiàn)。

　　另外，澳大利亞張任謙心臟研究所生物信息學(xué)家Joshua Ho指出，研究人員面臨的一個挑戰(zhàn)就是規(guī)模問題。經(jīng)典的RNA測序?qū)嶒炌松倭繕颖荆玸cRNA-seq研究中則含有成千上萬個樣本。而當(dāng)前工具在遭遇十倍甚至百倍的樣本時，其效率通常就會降低。

　　即使是一個看似簡單的問題——例如，好的細(xì)胞制備工作包含什么，在scRNA-seq的世界也是復(fù)雜的?！盎蛟S因為目標(biāo)不同，因此不同測序方法需要不同的工具分析數(shù)據(jù)?！盠un說。

　　例如，一種最常見的單細(xì)胞分析類型就是維數(shù)約減，這一過程就能夠簡化數(shù)據(jù)集以促進(jìn)對相同細(xì)胞的識別。英國桑格學(xué)院研究所計算機(jī)生物學(xué)家Martin Hemberg認(rèn)為，scRNA-seq數(shù)據(jù)能夠把單個細(xì)胞描繪成為“具有20000個基因表達(dá)值的一覽表”。而諸如主成分分析法(PCA)和t-分布鄰域嵌入算法(t-SNE)等維數(shù)約減算法則能有效地將這些形狀投射到兩個或三個維度，從而使得相似的細(xì)胞聚集在一起。

　　另外一種流行的應(yīng)用就是擬時分析。2014年，美國華盛頓大學(xué)生物學(xué)家Cole Trapnell就開發(fā)了首個此類工具，名為Monocle。該工具能夠利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法來對scRNA-seq實驗性的數(shù)據(jù)進(jìn)行推斷。

　　諸如哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Peter Kharchenko開發(fā)的Pagoda等工具還能夠解決亞群特征檢測和空間位置確定等信息，其能利用組織中基因表達(dá)的分布數(shù)據(jù)確定每一個組織中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)表達(dá)情況。

　　此外，紐約基因組研究中心研究者Rahul Satija開發(fā)了一種名為Seurat的工具，該工具能夠利用這些數(shù)據(jù)將細(xì)胞定位在三維空間中的點?！拔覀冎詫⑵涿麨榇虬黃eurat，是因為這些點提醒我們想起點彩派畫家繪畫中的點。”Satija說。

　　如今，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了一些即用型的檢測“流水線”，當(dāng)然還有一些端對端的圖像工具，包括一些商業(yè)性的SeqGeq包以及一些成對兒的網(wǎng)絡(luò)開放性工具，比如Granatum和ASAP(自動的單細(xì)胞分析流水線，the Automated Single-cell Analysis Pipeline)；Granatum和ASAP能夠利用網(wǎng)絡(luò)瀏覽器提供相對簡單、交互式的工作站來幫助科學(xué)家們以圖形化的模式來深度分析數(shù)據(jù)；目前這兩個工具能夠更好地幫助科學(xué)家們進(jìn)行日常的測序工作。

　　充當(dāng)“多面手”

　　盡管定位于特定任務(wù)，這些工具通常能處理各種問題。例如，Seurat能助力細(xì)胞亞群分析，Regev用來鑒別新的免疫細(xì)胞類型。

　　實際上，加州大學(xué)圣迭戈分校生物信息學(xué)家Gene Yeo表示，大多數(shù)的scRNA-seq工具都是基于R語言的Unix程序或軟件包編程的，但相對而言，很少有生物學(xué)家在這些環(huán)境中工作。即便是這樣，他們也可能沒有時間下載和配置所有工作，使這些工具真正發(fā)揮作用。

　　不過，研究人員已經(jīng)開發(fā)了一些即用型的流程。還有端到端的圖形工具，包括來自FlowJo的商業(yè)化GenSeq軟件包，以及一對開源的Web工具：來自Garmire集團(tuán)的Granatum和來自瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院Bart Deplancke實驗室的ASAP(自動單細(xì)胞分析流程)。

　　ASAP和Granatum使用Web瀏覽器提供相對簡單的交互式工作流程，使研究人員能夠以圖形的方式探索數(shù)據(jù)。在用戶上傳了數(shù)據(jù)后，軟件會逐步走完他們的步驟。對于ASAP而言，這意味著通過可預(yù)處理、可視化、聚類和基因表達(dá)差異分析獲取數(shù)據(jù)；Granatum還允許擬時間分析和蛋白質(zhì)交互作用數(shù)據(jù)的整合。

　　Garmire和Deplancke也都表示，ASAP和Granatum旨在讓生物信息等多個領(lǐng)域的研究人員共同合作。研究人員曾經(jīng)認(rèn)為，“(生物信息學(xué)家)獲取數(shù)據(jù)并產(chǎn)生結(jié)果是十分神奇的?！毕耐拇髮W(xué)博士生、Granatum首席開發(fā)人員Xun Zhu表示，“現(xiàn)在研究人員可以參與一些參數(shù)的調(diào)整，這是一件好事?！?

　　仍需謹(jǐn)慎

　　當(dāng)然，這些工具并不是在每一種情況下都是完美的。例如一種能夠精確鑒別細(xì)胞類型的“流水線”或許在進(jìn)行擬時間分析上并不擅長。此外，加州大學(xué)伯克利分校生物統(tǒng)計學(xué)家Sandrine Dudoit表示，一些適當(dāng)?shù)姆椒ɑ蛟S還具有一定的數(shù)據(jù)依賴性。

　　這些方法和參數(shù)可能需要根據(jù)序列長度等變量進(jìn)行調(diào)整。不過，英國癌癥研究所的John Marioni認(rèn)為，重要的是不要完全信任它們?！叭藗儾豢赡苤灰驗樾l(wèi)星導(dǎo)航讓自己開車沖進(jìn)河里就這樣做?！彼f。

　　對于初學(xué)者而言，嚴(yán)謹(jǐn)是非常必要的，生物信息學(xué)工具幾乎總能給出一個答案，那么問題是，這些答案意味著什么？對此，科學(xué)家建議進(jìn)行一些探索性分析，同時對人們選擇的算法進(jìn)行一些假設(shè)性的研究。

　　而Satija指出，有些分析性的任務(wù)仍然極具挑戰(zhàn)性，包括將來自實驗條件下或有機(jī)體中的數(shù)據(jù)同來自不同組學(xué)整合的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比。

　　不過，目前研究人員能夠使用足夠多的工具進(jìn)行研究，而那些對其感興趣的科學(xué)家也在不斷鉆研。每種新型工具都能揭示生物學(xué)的另一面，因此只要時刻關(guān)注科學(xué)，人們就能做出明確的選擇。

　　編輯點評
　　美國馬薩諸塞州博德研究所研究員Aviv Regev等人利用scRNA-seq對2400個免疫系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行探查時，無意中發(fā)現(xiàn)了一些具有潛在T細(xì)胞激活活性的樹突細(xì)胞。新的研究還在繼續(xù)，目前先關(guān)的研究顯示新軟件讓單細(xì)胞測序更簡單，還可以充當(dāng)“多面手”。當(dāng)然，這些工具并不是在每一種情況下都是完美的，在研究的道路上還需謹(jǐn)慎。